Volume 6, Number 20 (7-2016)                   JCPP 2016, 6(20): 179-190 | Back to browse issues page



DOI: 10.18869/acadpub.jcpp.6.20.179

XML Persian Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Mahdavi S, Alimadadi A, Kashefi B, Ghaem Maghami S A, Asgharzadeh A. Evaluating the Effects of Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) and Hormone Levels on In-vitro Micropropagation of Peperomia (Peperomia magnoliifolia). JCPP. 2016; 6 (20) :179-190
URL: http://jcpp.iut.ac.ir/article-1-2565-en.html

Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran. , alimadadi.a@gmail.com
Abstract:   (976 Views)

Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) have been proposed as a useful tool for enhancing plant growth. However, only few studies have examined the application of PGPR in in-vitro plant micropropagation. This study was aimed at evaluating the effects of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) and hormone levels on in-vitro micropropagation of Peperomia. The experiment was conducted in a factorial design based on completely randomized design with three replications. Factors comprised of plant growth promoting rhizobacteria (including 0=control (without bacteria), 1=Azospirillum lipoferum, 2=Pseudomonas fluorescent) and hormone levels (including 0=control (without hormone), 1=1.5 mg/l IAA + 1 mg/l 2ip and 2=double the treatment 1). Before planting, medium surface was inoculated with 0.08 ml of liquid culture of bacteria and then sterilized axillary buds were cultured. Growth characteristics were measured at two and four weeks after planting. Bacteria and hormone interaction effect was significant in terms of total root length and mean root length. Treating with Azospirillum (without hormone) led to a greater root number, compared to other treatments. Bacteria inoculation had a significant effect on shoot length and leaf number. Inoculation with both bacteria resulted in a greater shoot length compared to control, i.e. it led to a 1.5-fold increase in shoot length. Concomitant application of bacteria and hormone led to a decreased leaf number. In general, bacterial inoculation appeared to be more beneficial to the rooting attributes.

Full-Text [PDF 440 kb]   (413 Downloads)    

بررسی اثر باکتری‌های محرک رشد گیاهی و سطوح هورمون بر ریزازدیادی درون‌شیشهای پپرومیا (Peperomia magnoliifolia)

سحر مهدوی1، احمد علیمددی2*، بهاره کاشفی3

سید علی قائم‌مقامی4 و احمد اصغرزاده5

(تاریخ دریافت: 20/2/1393 ؛ تاریخ پذیرش: 20/3/1394)

چکیده

باکتری­های محرک رشد گیاهی به‌عنوان یکی از راه‌های بهبود رشد گیاه محسوب می‌شوند. اطلاعات ناچیزی در ارتباط با امکان استفاده از این موجودات در تحقیقات ریزازدیادی درون‌شیشه‌ای گیاهان موجود است. هدف از این تحقیق بررسی اثرات باکتری محرک رشد گیاهی و سطوح هورمون بر روی تکثیر گیاه پپرومیا از طریق کشت بافت بود. آزمایش به‌صورت طرح فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی با سه تکرار اجرا شد. فاکتور باکتری محرک رشد شامل سطوح: شاهد (بدون باکتری)، Azospirillum lipoferum وPseudomonas fluorescent و فاکتور هورمون شامل: بدون هورمون، سطح هورمون برابر با 5/1 میلی‌گرم در لیتر IAA و 1 میلی‌گرم در لیتر 2ip و مقدار هورمون دو برابر غلظت قبلی بودند. قبل از کشت، سوسپانسیون باکتری‌ها، بر روی محیط کشت و زیر ریزنمونه تلقیح شد. نتایج نشان داد اثر متقابل هورمون و باکتری بر کل طول ریشه و میانگین طول ریشه معنی‌دار بود. تیمار Azospirillum بدون باکتری دارای بیشترین طول ریشه بود. در دو هفته اول، اثر اصلی باکتری بر طول ساقه و تعداد برگ معنی‌دار بود. تلقیح ریزنمونه‌ها با هر دو باکتری نسبت به شاهد باعث افزایش معنی‌دار طول متوسط شاخه­های باززا شده گردید. افزایش طول ساقه در تیمارهای باکتری نسبت به شاهد در حدود 5/1 برابر بود. استفاده هم‌زمان از باکتری و هورمون باعث کاهش تعداد برگ شد. در کل نتایج نشان داد تلقیح ریزنمونه‌ها با باکتری، اثرات یکسانی بر صفات مختلف نداشت و اثرات مثبت باکتری بیشتر در ارتباط با خصوصیات ریشه بود.

واژه­های کلیدی: باکتری محرک رشد گیاهی، کشت بافت، هورمون، پپرومیا

1 و 3. به‌ترتیب دانشجوی کارشناسی ارشد و استادیار، رشته بیوتکنولوژی،‌ گروه کشاورزی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان

2 و 4. به‌ترتیب استادیار و مربی، گروه تولیدات گیاهی و کشاورزی پایدار، پژوهشکده کشاورزی، سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران، تهران

5. استادیار، بخش تحقیقات بیولوژی خاک، مؤسسه تحقیقات خاک و آب، کرج

*. مسئول مکاتبات، پست الکترونیکی: alimadadi.a@gmail.com m-askary@araku.ac.ir

مقدمه

کشت بافت گیاهی عبارت است از رشد سلول، بافت و یا اندام گیاهی در یک محیط غذایی مصنوعی استریل که به‌صورت جامد یا مایع تهیه می­شود. این روش به‌عنوان یکی از شاخه­های زیست­فناوری، کاربرد گسترده­ای در کشاورزی دارد. در کشت بافت، قسمتی از گیاه به نام ریزنمونه که ممکن است بخشی از ساقه، برگ، جوانه و یا یک سلول باشد، در محیط کنترل شده کشت می‌شود. در واقع در کشت درون‌شیشه­ای محیط کشت بستری برای رشد گیاه است و ترکیبی از مواد شیمیایی و آلی برای رشد سلول­ها و بافت­ها می­باشد (15).

            استفاده از ریزجانداران خاک‌زی در تولید کودهای زیستی در دهه‌های پیش، توسعه بسیاری یافته است و امروزه طیف وسیعی از باکتری­های خاک‌زی (انواع ریزوبیوم، سودوموناس، ازتوباکتر، آزوسپریلوم، باسیلوس و غیره)، قارچ­ها (همزیست و غیرهمزیست) و جلبک­ها با
مکانیسم­های مختلف برای تولید کودهای زیستی استفاده می­شوند (16). امروزه کودهای زیستی در فرمولاسیون­های متفاوت برای محصولات مختلف کشاورزی استفاده می­شوند و اهمیت آنها هر روزه در حال افزایش می‌باشد، اما اطلاعات بسیار کمی در ارتباط با امکان استفاده از این موجودات در تحقیقات درون‌شیشه ای از جمله کشت بافت گیاهی در دسترس می‌باشد. با توجه به اینکه این ریزجانداران انواع مواد را به محیط اضافه می­کنند، احتمال اینکه بر روی مراحل مختلف کشت بافت از ایجاد کالوس تا مرحله انتقال به خاک اثرات مثبتی داشته باشند، وجود دارد. این باکتری­­ها ممکن است ریزوسفر، سطح ریشه و یا حتی فضای بین سلولی را کلونیزه نمایند (9). باکتری­های ریزوسفری محرک رشد گیاه می­توانند با استفاده از مکانیزم­های مختلفی از جمله تثبیت نیتروژن، تولید هورمون­های گیاهی (اکسین، سیتوکینین، جیبرلین)، انواع ویتامین­ها و اسیدهای آمینه، افزایش حلالیت ترکیبات نامحلول مثل فسفر و پتاسیم، تولید سیدروفورها و تولید آنزیم ACC دآمیناز مؤثر در کاهش اثرات سوء اتیلن تنشی، به رشد بهتر گیاه کمک می­کنند (5).

در ارتباط با کاربرد باکتری­های محرک رشد گیاه در کشت بافت گیاهی گزارش­های اندکی موجود است. لارابرو و همکاران (8) دو باکتری محرک رشد گیاه شامل Azospirillum brasilense و Azotobacter chroococcum را در کشت بافت گیاه فوتینیا (Photinia ×fraseri) در مرحله ریشه­زایی به‌کار بردند. باکتری A. brasilense اثرات مثبتی بر روی زمان
ریشه­دهی، وزن خشک و تر ریشه و وزن خشک و تر گیاه داشت. درحالی‌که A. chroococcum اثر معنی­داری بر روی خصوصیات گیاه نداشت. استفاده از باکتری Pseudomonas sp. در گیاهچه­های حاصل از کشت بافت سیب­زمینی باعث بهبود تعداد ریشه (24 - 19 درصد)، وزن خشک ریشه (44 - 21 درصد) و طول ساقه (28 - 26 درصد) شد (4). کاپور و همکاران (7) بیان نمودند تلقیح گیاهچه­های کشت بافتی در گیاهان مختلف با قارچ مایکوریزا می‌تواند باعث توسعه سیستم ریشه­ای، افزایش کارایی فتوسنتز، بهبود جذب آب و مواد غذایی، کاهش عوامل بیماریزا و کاهش اثرات تنش­های محیطی شود. جایزمی وگا و همکاران (6) مشاهده نمودند استفاده از Bacillus spp. بر روی گیاهچه‌های کشت بافتی موز، باعث بهبود رشد و غلظت عناصر غذایی در برگ شد. هم‌چنین راسو و همکاران (13) مشاهده نمودند Azospirillum brasilence اثرات مفیدی بر ریشه‌زایی و سازگاری گیاه کشت بافتی
گلابی داشت. کاربرد این باکتری باعث بهبود وزن ریشه، فعالیت ریشه، رشد گیاه و حمایت گیاه در برابر بیماری ریشه شد.

            گیاه پپرومیا رقم گرین (Peperomia magnoliifolia) یکی از گیاهان زینتی پرمصرف در دنیا و ایران می باشد. پپرومیا گیاهی است گرمسیری با برگ­های چرمی شکل و قاشقی، دارای نیاز آبی و نوری کم و رشد سریعی ندارد. رشد کم این گیاه اهمیت تکثیر از طریق کشت بافت را توجیه می نماید. گیاه پپرومیا به‌عنوان یک گیاه زینتی با رشد کم، نمونه خوبی برای بررسی تأثیر درون‌شیشه‌ای این باکتری­ها بود (3). در مورد اثرات درون‌شیشه‌ای باکتری‌های محرک رشد گیاهی در کشت بافت، گزارش­های بسیار اندکی موجود است و تحقیق
بر روی این موضوع ضروری به‌نظر می­رسد. این تحقیق با هدف ارزیابی اثرات باکتری­های محرک رشد گیاهی و سطوح هورمون بر رشد ریزنمونه‌های پپرومیا در شرایط درون‌شیشه­ای انجام شد.

مواد و روش­ها

گیاه پپرومیا رقم گرین (Peperomia magnoliifolia) جهت نمونه‌برداری در گلخانه و تحت شرایط نور، آب و مواد غذایی مناسب نگهداری شده، ریزنمونه­ها از گیاه جدا شده و به آزمایشگاه منتقل گردیدند. در انتخاب ریزنمونه­ها دقت لازم به‌منظور انتخاب ریزنمونه­های سالم و عاری از بیماری و یا آسیب دیدگی به‌عمل آمد. ریزنمونه‌ها شامل جوانه جانبی پپرومیا از گیاه جدا شده و ضدعفونی گردیدند. ضدعفونی ریزنمونه‌ها شامل مراحل آبشویی با آب شیر به‌مدت 20 دقیقه، اتانول 70% به‌مدت 1 دقیقه و هم‌چنین محلول هیپوکلریت سدیم (با 5% کلر فعال) با غلظت 20 درصد به‌همراه چند قطره از محلول تویین به‌مدت 30 دقیقه انجام گرفته و سپس سه مرتبه آبشویی با آب مقطر استریل انجام شد. کلیه مراحل بعد از آبشویی اولیه، در زیر هود لامینار انجام پذیرفت.

            آزمایش به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً
تصادفی با 3 تکرار و در هر تکرار 7 نمونه صورت
گرفت. کشت نمونه‌ها در شیشه‌های مک‌کارتی انجام شد. فاکتورها عبارت بودند از: 1- تلقیح با باکتری شامل سه سطح (شاهد (بدون باکتری)، Azospirillum lipoferum و
 Pseudomonas fluorescent) و 2- مقدار هورمون شامل سه سطح (شاهد (بدون هورمون)، ترکیب 2ip 0.5 mg/l +
IAA 0.2 mg/l و غلظت دو برابر تیمار قبلی). برای انجام آزمایش، از محیط کشت پایه MS (1962) که دارای
5/2% (w/v) ساکارز و 6/0% (w/v) آگار بود استفاده شد. pH به‌میزان 8/5 توسطHCl و NaOH تنظیم شد و محیط کشت در دمای 121 درجه سانتی‌گراد، فشار 1 اتمسفر و به‌مدت 20 دقیقه اتوکلاو گردید.

            مایه تلقیح باکتری در محیط کشت اختصاصی هر کدام از باکتری­ها در ارلن­های 150 میلی­لیتر بر روی شیکر دورانی با 120 دور در دقیقه در دمای 25 درجه سانتی‌گراد کشت داده شدند. پس از 72 ساعت تعداد باکتری در واحد حجم به روش شمارش کلونی شمارش شده و مقدار 08/0 میلی‌لیتر از باکتری (c.f.u. m/l 107) در زیر هر ریزنمونه استفاده شد (8 و 13). مایه تلقیح باکتریایی قبل از انجام کشت ریزنمونه درون‌شیشه (در سطح محیط کشت) به‌وسیله سمپلر تلقیح شدند (شکل 1).

            کلیه مراحل کشت به‌صورت کاملاً استریل و با رعایت اصول ایمنی آزمایشگاهی انجام گرفت که به‌عنوان مثال می­توان استفاده از لامپ UV در اتاق کشت به‌مدت 10 دقیقه قبل از شروع کار، هم‌چنین ضدعفونی سطوح با الکل طبی و نیز ضدعفونی تمام وسایل و مواد مورد استفاده به‌وسیله اتوکلاو و رعایت اصول حرفه­ای کشت بافت در زیر هود لامینار را نام برد. ریزنمونه ضدعفونی شده آماده کشت، با رعایت شرایط گفته شده، طوری‌که به‌خوبی با محیط کشت در تماس باشد، کشت داده شد. کشت­ها در شرایط 25 درجه سانتی­گراد در اتاق کشت با طول روز 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، دمای 25 درجه سانتی­گراد و شدت نور 2000 لوکس قرار گرفتند (15).

            داده­برداری از نمونه­ها شامل اندازه­گیری تعداد برگ، تعداد ریشه، طول ریشه، طول ساقه، تعداد جوانه جانبی و نابه‌جا و توسعه برگی انجام شد. اندازه‌گیری خصوصیات، دو هفته و چهار هفته بعد از کشت صورت گرفت. کالوس‌زایی و جوانه‌‌های نابه‌جا در آزمایش مشاهده نشد. داده‌ها توسط نرم‌افزار SAS 9.1 تجزیه و نمودارها توسط نرم‌افزار Excel رسم گردید. آنالیز آماری با استفاده از خطای آزمایشی انجام شد و مقایسه میانگین­ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح
5 درصد صورت گرفت.

AWT IMAGE  AWT IMAGE  AWT IMAGE

شکل 1. مراحل مختلف آزمایش A: کشت ریزنمونه و باکتری، B: رشد جوانه و C: رشد شاخساره و ریشه‌زایی

نتایج

نتایج تجزیه واریانس اثرات تلقیح باکتری و سطوح هورمون بر خصوصیات رشدی ریزنمونه جوانه جانبی گیاه پپرومیا در هفته دوم و چهارم بعد از کشت در جداول 1 و 2 مشاهده می­گردد. جدول 3 نیز بیانگر مقایسه اثرات اصلی هورمون و باکتری می‌باشند.

تعداد برگ

نتایج تجزیه واریانس نشان داد در تاریخ اول، اثر تلقیح با باکتری بر تعداد برگ پپرومیا معنی‌دار شد (01/0P < ) و اثر هورمون و هم‌چنین اثر متقابل غیر معنی­دار بود (جدول 1). تلقیح با هر دو نوع باکتری باعث کاهش معنی‌دار تعداد برگ نسبت به شاهد گردید که این امر نشان‌دهنده اثر منفی باکتری بر ظهور برگ می‌باشد (جدول 3). تأثیر باکتری بر تعداد برگ دقیقاً برعکس تأثیر بر طول شاخه بود و این نتیجه نشان می‌دهد که تلقیح با باکتری باعث افزایش طول میان‌گره گردیده است. در تاریخ دوم، اثر تلقیح با باکتری و هم‌چنین اثر متقابل بر تعداد برگ باززا شده پپرومیا معنی‌دار شد (به‌ترتیب 05/0P <  و 01/0P < ؛ جدول 2). در تیمار بدون باکتری، ‌با افزایش سطح هورمون از صفر به 2 (به‌ترتیب 4/3 و 3/2) اختلاف معنی‌دار در تعداد برگ مشاهده شد. در هر دو سطح 1 و 2 هورمون، استفاده هم‌زمان از باکتری و هورمون باعث کاهش معنی‌دار تعداد برگ شد و روند مخالفی نسبت به سطح صفر هورمون، که تمامی تیمارهای باکتری اختلافی با یکدیگر نداشتند، داشت (شکل 2). به‌نظر می‌رسد استفاده هم‌زمان از باکتری و هورمون باعث افزایش بیش از حد سطح هورمون‌ها در محیط کشت شده و این عامل تأثیر منفی در تعداد برگ داشته است. نتایج به‌دست آمده بعد از یک ماه،‌ روند مشابهی نسبت به اندازه‌گیری اول داشت.

طول ساقه باززایی شده از جوانه جانبی

همانند تعداد برگ، اثر تلقیح با باکتری بر طول شاخه باززا شده پپرومیا در تاریخ اول معنی‌دار شد (01/0P < ) و اثر سطوح هورمون و هم‌چنین اثر متقابل غیر معنی­دار بود (جدول 1). برخلاف تعداد برگ، تلقیح با هر دو نوع باکتری باعث افزایش طول ساقه گردید (جدول 3). هر دو نوع باکتری به‌طور
متوسط باعث افزایش 60 درصدی طول شاخساره شدند. افزایش طول ساقه از دو طریق شامل افزایش تعداد میان‌گره و یا افزایش طول میان‌گره امکان‌پذیر است. با توجه به اثر منفی باکتری بر تعداد برگ، می‌توان نتیجه گرفت که استفاده از باکتری باعث افزایش طول میان‌گره و در نتیجه طول شاخساره شده است.

     در تاریخ دوم، اثر تلقیح با باکتری و اثر متقابل، غیر معنی­دار و اثر هورمون بر طول ساقه های باززا شده معنی دار بود
(05/0P <  ؛ جدول 2). افزایش سطح هورمون به‌مقدار دو برابر (76/3 سانتی‌متر) باعث افزایش طول ساقه نسبت به شاهد و
 

جدول 1. تجزیه واریانس اثر سطوح مختلف هورمون و باکتری بر صفات مربوط به رشد درون‌شیشه‌ای ریزنمونه جوانه جانبی

 پپرومیا (تاریخ اول)

اثرات

درجه آزادی

میانگین مربعات (MS)

تعداد برگ

طول ساقه

تعداد ریشه

کل طول ریشه

میانگین طول ریشه

تعداد جوانه

توسعه برگی

هورمون

2

ns23/0

ns 32/4

ns 18/0

* 95/12

**41/1

ns86/14

ns97/12

باکتری

2

**70/11

** 11/15

ns03/0

ns82/4

ns37/0

ns78/5

ns94/0

هورمون × باکتری

4

ns67/1

ns07/1

ns62/8

*79/7

*41/0

ns84/7

ns27/6

خطای آزمایشی

18

75/0

59/1

17/3

30/2

14/0

29/6

44/6

خطای نمونه‌برداری

65

31/0

29/0

52/0

33/3

04/0

79/0

32/1

*: معنی‌دار در سطح 5 درصد، **: معنی‌دار در سطح 1 درصد و ns: غیر معنی‌دار

جدول 2. تجزیه واریانس اثر سطوح مختلف هورمون و باکتری بر صفات مربوط به رشد درون‌شیشه‌ای ریزنمونه جوانه جانبی گیاه

پپرومیا (تاریخ دوم)

اثرات

درجه آزادی

میانگین مربعات (MS)

تعداد برگ

طول ساقه

تعداد ریشه

کل طول ریشه

میانگین طول ریشه

تعداد جوانه

توسعه برگی

هورمون

2

ns07/0

*71/9

*81/43

** 47/308

*84/6

*49/25

*58/18

باکتری

2

*84/3

ns53/1

**20/67

** 32/306

ns78/1

ns16/17

ns32/0

هورمون × باکتری

4

**83/3

ns95/1

ns64/4

ns97/56

ns19/1

ns20/29

ns21/5

خطای آزمایشی

18

83/0

10/2

38/8

10/29

37/1

44/11

07/6

خطای نمونه‌برداری

56

42/0

41/0

45/1

48/28

90/0

92/7

28/1

*: معنی‌دار در سطح 5 درصد، **: معنی‌دار در سطح 1 درصد و ns: غیر معنی‌دار

هورمون یک گردید (به‌ترتیب 51/2 و 56/2 سانتی‌متر)
(جدول 3). این افزایش در حدود 50 درصد نسبت به دو تیمار دیگر بود.

تعداد ریشه باززا شده

نتایج تجزیه واریانس نشان داد در تاریخ اول، هیچ‌کدام از اثرات اصلی و متقابل تیمارها بر تعداد ریشه معنی‌دار نبود (جدول 1). میانگین تعداد ریشه در ریزنمونه 4/2 ریشه در شاخه بود. در تاریخ دوم، اثرات اصلی تلقیح با باکتری و سطوح هورمون بر تعداد ریشه باززا شده معنی‌دار (به‌ترتیب 01/0P <  و 05/0P <) و اثر متقابل این دو فاکتور غیر معنی‌دار بود (جدول 2). سطوح هورمون صفر و یک اختلاف معنی‌دار با یکدیگر نداشتند و سطح هورمون دو برابر، باعث کاهش 50 درصدی تعداد ریشه باززا شده گردید (جدول 3). تیمار باکتری Azospirillum و تیمار بدون باکتری نیز اختلاف معنی‌دار با یکدیگر نداشتند اما تلقیح با باکتری Pseudomonas باعث کاهش معنی‌دار (در حدود 45 درصد) نسبت به دو تیمار دیگر شد (جدول 3). با مقایسه این دو اثر می‌توان مشاهده نمود که تأثیر تیمار Pseudomonas شبیه تیمار هورمون دو برابر می‌باشد و این کاهش تعداد ریشه می‌تواند به‌علت افزایش بیش از حد سطح هورمون در حضور باکتری Pseudomonas باشد.

AWT IMAGE Type of Study: Research | Subject: General


Add your comments about this article : Your username or email:
Write the security code in the box

Send email to the article author


© 2015 All Rights Reserved | Isfahan University of Technology - Journal of Crop Production and Processing

Designed & Developed by : Yektaweb